近日，中国医学科学院北京协和医学院谢秋等团队合作在Advanced Science杂志（IF：14.1，中科院1区top）在线发表题为“Excessive DNA Double-Strand Breaks-Associated 3D Genome Reorganization Contributes to Neural Tube Defects with Folate Deficiency”的研究论文。该研究报道了过多的DNA双链断裂相关的三维基因组重组对叶酸缺乏神经管缺陷的影响。

当前的测序技术能够以碱基对分辨率对DNA断裂点进行全基因组定位。在该研究中，团队利用在碱基对分辨率下建立的DSB富集工作流程，分析了DSB在活性基因中所起的作用，这些活性基因会导致RNA聚合酶II（Pol II）停滞以及R环的形成，从而在三维基因组调控中引发伴有叶酸缺乏的NTD表型。结果发现，NTD小鼠携带DSBs，其与三维基因组结构紊乱相关。与DSB相关的染色质环失调出现在与神经管闭合相关的基因中，这些基因在人NTD中异常表达。综合来看，在缺乏叶酸的NTD患者中，与过度DSB相关的三维基因组结构的破坏导致了与神经管闭合相关的基因的失调。

值得一提的是，昊为泰生物参与了该研究中的ATAC-seq、CUT&Tag测序及转录组测序多组学技术，助力客户揭示DSB相关的基因组及转录信息，让我们一览文章的主要结果吧。

1.由于叶酸缺乏导致的NTD小鼠体内存在DSB与三维基因组结构的破坏有关

人类和小鼠细胞的拓扑染色质域在同线区域显示出非常相似的拓扑结构域结构，这表明小鼠可以作为研究NTD中三维基因组变化的合适模型。为了研究叶酸缺乏如何全面调节NTD中的三维基因组结构，团队使用甲氨蝶呤（MTX）成功建立了NTD小鼠模型。MTX是一种强效的类似物，属于一类特定的二氢叶酸还原酶（DHFR）抑制剂，可阻止叶酸转化为其活性形式。

为了研究由NTD引起的三维结构变化的特定影响，使用Hi-C数据在NTD大脑和脊髓样本中识别染色质环，并以10 kb的分辨率和0.95的质控阈值来计算全基因组相互作用以检测环的识别（图1A）。结果发现，在MTX诱导的NTD小鼠中，神经管闭合过程中可能存在持续的染色质环变化。

染色质三维结构能够调节基因表达，进而研究了小鼠NTD组织中的基因转录是否受到染色质环结构的影响。结果显示，Zeb1（神经管闭合相关基因）转录活性的改变与染色质环的变化同时发生（图1B）。此外，Ascl1能促使小鼠成纤维细胞生成具有功能的多巴胺能神经元，其表达在NTDs下会显著降低，同时伴有染色体环的缺失（图1C）。

接下来，对大脑和脊髓样本中差异环所包含的基因进行GO通路分析。发现DNA修复途径显著富集（图1D、E），这表明在NTD的发展过程中发生了DNA损伤和DNA修复缺陷。为了探究在神经管闭合过程中染色质环与DSBs之间的关系，使用免疫荧光染色检测了E9.5 NTD胚胎中聚合体亚基RAD21和DNA损伤标志物gH2AX的表达。结果表明，与对照组的基线DSBs相比，RAD21与DSBs显著富集在NTD小鼠的大脑和脊髓的异常神经系统中（图1F、G），这表明叶酸缺乏诱导的伴有DSBs的NTD小鼠与三维基因组结构的破坏有关。

图1 MTX诱导的伴有DSBs的NTD小鼠与3D基因组结构破坏相关

2.在缺乏叶酸的情况下活性基因中发生的DSBs会导致Pol II停滞以及三维基因组中R环形成

随着TAD层级的增加，DSB比率和基因转录活性也逐渐增加。在分析TAD的情况下，基因转录、DSB之间存在明显的相关性（图2A）。事实上，随着TAD的增加，DSB比率以及转录活性均会随着MTX的处理而增加。随后，通过 Peakachu鉴定小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的染色质环，发现在MTX处理后，有4486个环减少，5075个增加（图2B、C）。在经过MTX处理的mESCs、小鼠大脑以及脊髓中染色质环发生改变，这些变化在mESCs和小鼠组织中的保守性也被比较。只有小部分染色质环的变化在mESCs和小鼠组织中是保守的（图2D）。有趣的是，大多数与神经管闭合相关的基因都位于这些保守且改变的染色质环区域，这使得经过MTX处理的mESC细胞成为研究NTDs的有力模型。

同时，研究还发现了在MTX处理的mESC细胞中与差异性环锚点重叠的6787个DSB。这表明变化后的环更有可能集中在DSB区域（图2E）。重复出现多次的环锚点被指定为“繁忙锚点”，它们充当染色质相互作用的枢纽，而其他锚点则被归类为“正常锚点”（图2F）。对比分析表明，在使用MTX处理后，具有繁忙锚点的环与具有正常锚点的环相比，在根据锚点活性分类的特定染色质环锚点的出现率方面差异更为显著（图2G）。这支持了团队的假设，即染色体区域中染色质接触频率较高的区域更容易因叶酸缺乏而受到破坏，从而导致染色质环发生显著变化。

图2 MTX处理的mESCs诱导具有繁忙锚点的环取代

3.叶酸缺乏所致基因组DSBs的特征

为了消除内源性DSBs的影响，研究人员计算了MTX处理组和正常mESCs中每个基因组区域DSB富集程度的倍数变化（DSB比例）。结果表明，MTX处理后mESCs的DSB富集程度显著增加，整个基因组的平均增加倍数约为28.5倍（图3A）。此外，转录起始位点（TSS）附近诱导的DSB富集程度高于基因间区域和其他区域（图3B）。基因组区域的DSB比例与基因相对于TSS的距离呈负相关，且在TSS附近DSB比例极高（图3C）。

基因启动子和增强子的正常功能对于细胞内协调转录至关重要。接下来，研究人员关注了MTX处理后这些位置的DNA断裂情况。对十种不同染色质状态下的TssAs（激活启动子）和EnhAs（强激活增强子）的数量进行了计算。所进行的相关性分析表明，位于基因组区域内的TssAs和EnhAs的比例与这些区域的DSB比例呈正相关（图3D）。研究人员还在每类DSB分割区域中识别出了TssA相关基因，并使用DAVID进行了GO分析。位于DSB比例高的基因组区域内的TssA相关基因与基本生物学功能相关，例如mRNA加工、RNA剪接和DNA复制。这些基因还与DNA修复和细胞对DNA损伤刺激的反应功能有关（图3E），表明脆弱的活跃启动子会影响细胞中的基本过程，并且可能在DNA修复中也起作用。

接下来，研究人员确定了近端EnhAs为那些在TssAs附近上游或下游20 kb范围内，而远端EnhAs则是指在该区域内不存在TssAs的增强子。所进行的对比分析表明，近端和远端EnhAs的DSB比例显著高于没有EnhAs 的区域（p < 0.001，图3F）。

另外，利用ATAC-seq和ChIP-seq数据分析组蛋白修饰相关基因组区域的DSB富集情况，发现富集程度显著高于那些没有修饰的区域。这些结果表明在叶酸缺乏的情况下，DSB更倾向于发生在表观遗传修饰丰富的区域。

图3 MTX诱导的DSBs在启动子和增强子区域富集

4.与DSB相关的染色质环异常调控在神经管闭合相关基因中发生

为了确定DSB相关的染色质环失调是否会影响基因表达，研究人员分析了mESC中改变的环锚点和差异基因的重叠情况。共有43个差异基因在差异环锚点中富集（图4A）。然后，研究人员对这43个基因进行了GO通路分析，发现它们在神经管发育通路中显著富集（图4B）。具体而言，Hoxa1和Rgma在神经管形态发生过程中调节定向细胞分裂、细胞形状和微管动力学。Sox6和Nrg1在新皮层发育过程中调节背侧祖细胞身份和中间神经元多样性。这些变化可能与被H3K27me3信号标记的染色质环的缺失有关（图4D）。

图4-1 DSB相关的染色质环失调与差异基因表达相一致

DSBs是在转录过程中维持DNA三维构象的内在组成部分。基因组的结构会影响DSB形成的位点以及连接形成结构变异（SV）的位点对。为了评估这一点，研究人员使用Eagle C对Hi-C数据进行分析，以研究MTX处理在mESC、大脑和脊椎中诱导的新SV（图4E）。结果表明，MTX处理显著增加了mESC中的染色体易位（图4F）。此外，基因表达的显著变化似乎与附近的结构变化有关。例如，基因Dpp6已被报道会影响神经元的兴奋性和可塑性。由于叶酸缺乏诱导的mESC中的DSB染色体倒位导致Dpp6基因的截断（图4G）。此外，在小鼠脊椎中观察到SVs与其表达变化之间的相关性。研究人员在Gm20707和Gm49083这两个基因组区域发现了与NTDs相关的显著染色体倒位现象，这或许能够解释其表达量的增加情况（图4H）。

图4-2 DSB相关的染色质环失调与差异基因表达相一致

5.人NTDs中与神经管闭合相关基因的DSB相关染色质环的失调

当前的分析表明，DSBs和染色质环的变化对基因表达有直接且显著的影响。为了在人NTDs中验证这些结果，从患有NTDs的婴儿大脑中选取了560个神经管闭合相关基因中的90个显著差异基因，并使用NanoString进行分析，采用5种基因注释方法进行重叠分析。在检测到的基因中，有12个同时存在DSBs和染色质环的改变。值得注意的是，这12个基因在人NTD胎儿大脑中显示了表达的变化，并且先前与NTDs相关（图5A，B）。

为了检测叶酸缺乏诱导的DSBs对NTD基因重连环相互作用调控的影响，研究人员使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过将代表性差异环锚定在Ift122（上述12个基因之一）上，敲除了DSBs比例高的基因组区域。设计了3个sgRNA靶点。sgRNA1和sgRNA2靶向有DSB热点的Ift122基因座的远端启动子-增强子环，而sgRNA3靶向无DSB热点的Ift122基因座的近端启动子-增强子环（图5C）。

图5-1 人NTD中NTD基因与DSB相关的染色质环失调

首先，研究人员在小鼠胚胎成纤维细胞的3次生物重复中确认了Ift122位点的启动子-增强子环（图5D）。靶向sgRNA1和sgRNA2后，发现单细胞克隆1和2中的Ift122 RNA表达显著增加（图5E，F），这与NTD胎儿样本中的NanoString nCounter检测结果一致（图5B）。

图5-2 人NTD中NTD基因与DSB相关的染色质环失调

在这项研究中，研究人员使用多维数据集构建了叶酸缺乏的全基因组遗传图谱。结果表明，DSBs可以改变调控元件和基因之间的相互作用，并进一步影响转录活性。综上所述，当前研究表明，叶酸缺乏会引起一碳紊乱，导致DNA合成受损和DSBs的病理性增加。因此，神经管闭合相关基因的异常表达被认为是NTDs发生的重要机制之一。当前的发现强调了理解基因、它们的结构复杂性以及与DSBs相关的三维染色质结构的重要性。在叶酸缺乏的NTDs中，过多的DSBs相关的3D基因组结构破坏会导致神经管闭合相关基因的失调。这些模型有可能通过操纵三维染色质结构来帮助开发治疗干预措施。

图6 概念模型提示DSB和高阶染色质结构改变导致MTX诱导的NTDs神经发育异常

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