高盐废水常来自工业及家庭活动，尤其是在农业和工业中产生的大量含硝酸盐的废水。未经处理的废水会严重污染水源，并威胁人类健康。硫基自养反硝化(SADN)作为一种在低C/N比条件下有效去除硝酸盐的替代方法，已被广泛关注。然而，高盐环境会抑制大多数微生物的生长和代谢酶活性，从而影响反硝化过程的效率。因此，如何提高反硝化过程在高盐环境中的适应性成为了一个关键的研究课题。

近日，以自然资源部第三海洋研究所邵宗泽研究员、王勇博士为通讯作者，崔亮博士、王莎莎博士为共同第一作者的研究论文，在国际环境科学著名杂志Bioresource Technology（IF=9，一区Top）上发表。该研究利用昊为泰AccuMetaG^®宏基因组绝对定量测序专利技术，深入探讨了高盐条件下SADN过程中微生物功能基因的动态变化。研究表明，通过对盐耐性硫单胞菌（Sulfurimonas）的生物强化，能够显著提高反硝化反应效率，以应对高盐带来的挑战。研究首次将“宏基因组绝对定量”与“硫歧化-反硝化耦合”结合，为碳源受限、高盐环境下的高效脱氮提供了可复制的工程范式。

英文题目：Enhanced autotrophic denitrification under salinity stress by bioaugmentation of Sulfurimonas: performance evaluation, microbial community and response mechanisms

中文题目：耐盐Sulfurimonas生物强化在高盐胁迫下提升自养反硝化效率：性能评价、微生物群落与响应机制

发表期刊：Bioresource Technology

在线发表时间：2025年7月11日

本研究内容概要图

1.利用宏基因组绝对定量技术揭示了微生物重要代谢通路：通过KEGG数据库，研究揭示了在高盐环境下，硝酸盐还原与硝酸还原通路的基因绝对丰度显著增加，证明了这些路径在SADN系统中的重要性 。

 2.盐度对硫单胞菌的生长影响：通过16S rRNA扩增子测序发现低盐条件下的多样性较高。随着盐度增加，微生物的多样性逐渐下降。这一结果表明，高盐环境抑制了某些微生物的生长，增加了硫单胞菌的竞争优势。

3.生物强化的应用效果：硫单胞菌的生物强化显著提高了反硝化反应的效率，尤其是在盐度压力下，展示了其作为高效生物修复菌种的潜力。

本研究所用硫自养反硝化Sulfurimonas菌群为作者团队前期在深海热液区、近海沉积物等化能自养环境中分离获得。接种前，菌株在无机培养基中预培养72小时，培养基含硝酸钾（KNO₃），硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃·5H₂O）和元素硫颗粒。反应器为自制序批式生物膜流化床反应器（SBBR），底部填充30%的元素硫颗粒作为载体材料。人工模拟废水中主要含氮源为KNO₃（图1）。系统运行分为五个阶段：初始对照阶段（CK，1%盐度，不投加菌株）、阶段Ⅰ至Ⅳ分别对应1%、2%、3%、4%盐度下的生物强化运行。每阶段运行时间均为30天，反应周期为24小时。

图1. 硫填充序批式生物膜反应器（SBBR）示意图。

为分析系统运行效果，每阶段末尾采集水样，测定硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮、总氮、硫酸盐、硫化物、硫代硫酸盐等指标，采用标准比色法或离子色谱法；同时测定溶解氧（DO）与pH。利用16S rRNA（V3–V4区）扩增子测序分析微生物群落结构，之后利用昊为泰宏基因组绝对定量技术，对功能基因进行注释，分析盐度胁迫下微生物代谢功能的变化。此外，采用共现网络分析探究各微生物间的关联模式，明确关键功能菌的生态地位。

在建立了生物膜之后，SBBR反应器启动以提供稳定的反硝化性能（图2a）。在每个周期的第一阶段，系统接种进5 L 含有约30 mg N·L⁻¹硝酸盐的进水。初，在低盐度（1%）条件下，反应器的总氮去除率约为70%，表现出一定的自养反硝化能力。随着系统的运行和反应器的适应，特别是在加入了盐耐受硫单胞菌后，系统在更高盐度（3%）下的反硝化性能显著提升。系统终表现出稳定的反硝化效率，且总氮去除率稳定维持在98.79%（图2b）。

图2. 在生物强化条件下，随着盐度升高，SBBR反应器长期反硝化性能（a）和总氮去除效率（b）的变化。

为了更深入了解系统的工作机制，研究人员进一步分析了反硝化过程及其伴随的硫循环变化。图3展示了典型运行周期中各类化学物质的浓度变化。在图3a中，S2O3²⁻浓度在初的1天内迅速下降，表明其被优先用于电子供体参与反硝化反应。随后，S²⁻浓度开始缓慢上升，而SO₄²⁻浓度持续上升，说明部分中间产物进一步氧化生成硫酸盐。图3b中的NO₃⁻浓度在初阶段显著下降，并在4天内基本去除完全。整个过程中，NO₂⁻及NH₄⁺浓度始终维持在低水平，未出现积累，证明反硝化过程具有良好的完整性。图3c显示，在反硝化过程中，溶解氧（DO）浓度迅速下降，在2天内降至0.1 mg·L⁻¹以下，反映出系统进入厌氧状态，有利于反硝化反应的进行。同时，pH值逐渐从初始的7.8下降至6.5，说明系统中发生了质子生成过程，推测可能与SO₄²⁻的生成相关。

从这些结果可以看出，S2O3²⁻在反应初期作为电子供体被优先消耗，并伴随着S²⁻和SO₄²⁻的动态积累与转化，反映出复杂的硫循环过程在反硝化过程中起着关键作用。

图3. 在反硝化与硫歧化交替过程中，硫化物、硫代硫酸钠、硫酸盐（a），硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮（b），以及溶解氧和pH（c）的变化曲线。

为了评估盐度对微生物群落结构的影响，研究者进一步对1%、2%、3%、4%盐度条件下的反应器样品进行了16S rRNA扩增子测序。图4a展示了在不同盐度条件下，优势菌群在门水平和属水平的组成变化。Proteobacteria始终是主要的菌门之一，但在4%盐度下，Campylobacterota显著上升，占比超过40%。在属水平，硫单胞菌在低盐条件下相对丰度较低，而在3%和4%盐度下其丰度迅速提升，成为主导菌属，说明该菌对高盐环境具有良好的适应性。图4b中的冗余分析（RDA）进一步揭示了微生物群落组成与环境因子的相关性，其中硫单胞菌的丰度与NO₃⁻、SO₄²⁻显著相关。图4c显示，3%盐度SD阶段上层(L1)、中层(L2)、下层(L3)的微生物多样性显著低于反硝化阶段。门类以Campylobacterota、Desulfobacterota、Proteobacteria为主。属级方面，Sulfurimonas在L1-L3的丰度依次为65.94%、53.15%、28.13%，仍居主导，暗示其可能参与硫不均衡阶段(SD)过程。 针对SADN阶段的共现网络含327节点、1088边，平均度6.654，路径长3.125，R²=0.725，正相关占60.39%（图4d）。关键节点标准为Zi>2.5且Pi>0.62。Sulfurimonas与28节点相连，其中71.43%为负相关，竞争对象包括Sulfuricurvum、Thiobacillus、Sulfurivermis、Hydrogenovibrio；同时与Desulfocella、Ornatilinea、Calorithrix协同。表明Sulfurimonas通过竞争-合作共存维持系统脱氮稳定性。

图4. 在SADN阶段（a）和SD阶段（c）分别发生的门和属水平细菌群落演替；通过RDA评估了前10个优势属与关键环境参数之间的相关性（b）；基于所有样本ASV构建的整体网络（d），节点颜色代表不同优势门，边颜色表示节点间正相关（粉色）或负相关（绿色）。

为探索盐度胁迫下微生物代谢功能的变化，研究人员通过宏基因组绝对定量检测，对微生物相关基因功能进行了注释。图5a展示了二级代谢途径在不同盐度下的绝对丰度的变化趋势，其中能量代谢、细胞运动、转录等功能在3%盐度时为活跃，表明该盐度可能是适区间。图5b进一步显示，第三级路径的绝对丰度如氮代谢、脂肪酸代谢、氨基酸合成等均在3%时达到峰值，但在4%盐度下受到抑制。

图5. 对测序基因进行二级（a）和三级（b）代谢通路的注释统计结果，仅展示 p 值小于 0.05 的通路；横坐标表示绝对丰度。

此外，利用宏基因组绝对定量测序结果，研究者还聚焦于与反硝化过程密切相关的功能基因和关键酶类。图6a展示了反硝化过程中主要关键酶（如硝酸还原酶EC:1.7.7.2和亚硝酸还原酶EC:1.7.5.1）的绝对丰度。在3%盐度时，相关酶类表达水平明显提升。图6b则展示了包括narG、napA、nirS、norB、nosZ等功能基因在不同盐度下的绝对丰度。这些基因在3%盐度下显著富集，进一步说明该条件利于自养反硝化微生物的功能发挥。

图6. 与反硝化、同化硝酸盐还原、异化硝酸盐还原及固氮作用相关的代谢通路，以及关键酶（a）和功能基因（b）的绝对丰度。

该研究利用昊为泰微生物绝对定量测序技术，深入探讨了盐度变化对耐盐硫单胞菌生物强化的微生物群落功能基因和代谢通路的重要影响，揭示了其在高盐废水处理中发挥的重要作用。通过生物强化耐盐硫单胞菌，SBBR系统在4%盐度下依然表现出佳的反硝化性能和微生物功能状态。该系统不仅维持了高效、稳定的脱氮能力，同时也展现出良好的抗盐适应性。该研究成果为未来在类似环境下的废水处理提供了有力的技术支持和理论依据。