近日，南华大学附属第一医院刘江华教授及曹劲松博士团队在国际学术期刊《Advanced Science》发表新研究论文“Bacteroides Fragilis Exacerbates T2D Vascular Calcification by Secreting Extracellular Vesicles to Induce M2 Macrophages”，发现肠道脆弱拟杆菌通过分泌细胞外囊泡诱导M2巨噬细胞加重T2D血管钙化，为血管钙化发病机制提供了新的见解。在该研究中，团队首先筛选出了与T2D血管钙化相关的肠道细菌，随后分析了肠道细菌脆弱拟杆菌（BF）与巨噬细胞极化之间的因果关系，证实了BF在细胞水平和动物实验中均能诱导巨噬细胞向M2型极化转变。

值得一提的是，昊为泰生物在该研究中提供了16S rRNA测序及CUT&Tag测序技术服务，助力发现了关键的肠道菌群及关键靶点（详见研究主要结果）。

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）测序是研究蛋白质和DNA相互作用的新方法，通过将Protein A/G与Tn5转座酶融合，在目标蛋白特异性抗体的介导下，实现对蛋白结合区域附近DNA的切割和测序文库构建。与传统的ChIP-seq相比，CUT&Tag具有样本量要求低、实验周期短、灵敏度高等优势。

CUT&Tag技术在表观遗传学研究中有着广泛的应用和潜力，主要用于解析转录因子结合位点和组蛋白修饰的全基因组分布，探索染色质的三维结构及其功能。通过分析这些结合位点和修饰，可以揭示基因调控网络、表观遗传机制以及疾病发生的相关机制，为疾病研究和药物开发提供高效解决方案。

1.脆弱拟杆菌（BF）是一种与T2D相关且与巨噬细胞M2极化相关的肠道细菌

本研究从12名患有T2D和T2D血管钙化（VC）的患者身上采集了粪便样本，通过16S rRNA测序分析发现，只有拟杆菌门的表达显著上调（图1A），其中BF的表达显著增加了2.00倍（图1B）。对T2D小鼠模型的分析表明，在T2D发病两周后，肠道BF水平显著升高与基线水平（0周）相比增加了2.91倍（图1C）。在主动脉中还观察到了钙离子沉积（图1D）。相比之下，患有T2D VC的患者外周血中单核细胞/巨噬细胞的M2极化显著增加1.41倍（图1E、F）。在T2D患者与T2D VC患者之间存在显著差异的6项指标中，M2型巨噬细胞的ROC曲线下面积是所有血清学指标中大的（图1G）。此外，体外培养的BF被移植到糖尿病小鼠的肠道中。结果表明，骨髓中CD206和主动脉中Runx2的表达水平分别增加了1.77倍和1.67倍，并伴有钙离子沉积（图1H-K）。流式细胞术分析显示，外周血中单核细胞/巨噬细胞的M2型极化显著增加（1.41倍），而单核细胞/巨噬细胞的M1型极化无显著差异（图1L、M）。这些发现表明，BF是与T2D VC相关的肠道细菌，并与M2型巨噬细胞水平有关。

图1 肠道菌群与T2D VC及巨噬细胞极化的关联

2.细胞外囊泡的产生是BF诱导M2巨噬细胞生成并促进T2D VC的关键方式

细胞外囊泡（EV）在组织、细胞乃至物种之间充当着信息传递的关键载体。在该研究中，团队使用专用试剂盒提取了BF EV，其平均粒径为223.3 ± 21.9纳米（图2A）。这些EV具有双层膜、杯状结构（图2B），并且能够被血管平滑肌细胞（VSMC）和巨噬细胞内吞（图2C）。当VSMC受到BF EV刺激时，Alp基因显著上调；然而，Runx2显著下调，平滑肌标志物未显示出显著变化（图2D、E）。体内小动物成像显示，BF EV在小鼠口服灌胃后在胫骨和腹腔中积累（图2F）。当体外培养的巨噬细胞受到BF EV刺激时，它们呈现出M2巨噬细胞的纺锤形特征（图2G）；流式细胞术证实了巨噬细胞向M2表型的显著极化（图2H、I）。有趣的是，将VSMC与由BF EV刺激的巨噬细胞共同培养，会导致Runx2和Alp的显著上调，而αSma和Sm22α的显著下调（图2J、K）。在动物实验层面，向患有T2D的小鼠注射BF EV，会使骨髓中的M2型巨噬细胞数量显著增加1.81倍（图2L、M），同时小鼠主动脉中的Runx2和Alp也出现了显著上调（图2N）。此外，在用热灭活的BF阻断T2D小鼠肠道中BF的定植部位后，胃内给予BF EV显著促进了主动脉的成骨分化以及骨髓巨噬细胞的M2型极化（图2O、P）。这些结果表明，BF通过EV诱导巨噬细胞向M2型极化，从而促进主动脉钙化。

图2 BF EV对VC及巨噬细胞极化的影响

3.清除T2D小鼠体内的巨噬细胞可减轻BF EV诱导的VC

接下来，将chodronate脂质体（靶向清除巨噬细胞）通过尾静脉注入小鼠体内，并通过胃内给予BF EV（图3）。发现与对照脂质体组相比，chodronate脂质体组的粪便BF数量没有显著变化（图3A）。此外，无明显变化的是天冬氨酸转氨酶（AST）、血糖和血脂；然而，丙氨酸转氨酶（ALT）水平显著升高（图3B、C）。尤为重要的是，qRT-PCR分析显示，Runx2在主动脉中的表达显著下调了12.08 倍（图3D）。流式细胞术显示，外周血中的总巨噬细胞计数显著增加；外周血中的M1/M2单核细胞/巨噬细胞比例并无显著变化（图3E-G）。尽管骨髓中的M1巨噬细胞数量未见显著变化，但M2巨噬细胞的数量却显著增加（图3H-J）。ELISA结果显示，在清除巨噬细胞后，BF EV移植对T2D小鼠血清中的Serpine1水平没有显著影响（图3K）。这些结果表明，巨噬细胞是BF EV促进T2D VC的关键靶细胞。

图3分析巨噬细胞清除作用对BF EV加重小鼠T2D VC的影响

4.BF EV通过Sting-Mef2d信号通路促进巨噬细胞向M2型极化

EV通过Sting信号诱导免疫细胞活化，其过程由它们所携带的核酸介导。研究发现，7×10⁸个/ml的BF EV含有20.84 ng/µL的双链DNA（图4A）。光学显微镜观察和流式细胞术分析表明，使用C-176抑制巨噬细胞的Sting激活能够有效拮抗BF EV诱导的巨噬细胞向细长纺锤形M2型表型的极化（图4B-D）。

Mef2d是与巨噬细胞M2型极化密切相关的关键基因，并已得到广泛研究。qRT-PCR和蛋白质印迹分析表明，在BF EV诱导的巨噬细胞M2极化过程中，Mef2d和磷酸化的Mef2d水平与Sting水平的变化方式相同（见图4E-G）。共免疫沉淀证实Mef2d与Sting结合（见图4H）。生物信息学分析进一步显示，Mef2d和Sting的表面分子能够形成更好的嵌合体，特定氨基酸之间观察到了氢键（见图4I）。多色组织免疫荧光分析显示，在接受BF移植的T2D小鼠的胫骨中，Sting和Mef2d存在共定位现象（图4J-L）。CD206+Sting+、CD206+Mef2d+和 CD206+Sting+Mef2d+的信号显著高于对照组，分别增加了2.30倍、2.29倍和2.68倍（图4M-P）。此外，流式细胞术和免疫荧光分析表明，Mef2d过表达显著诱导了M2型巨噬细胞数量增加2.03倍（图4Q、R）。相反，Mef2d抑制导致M1型巨噬细胞极化显著增加1.50倍（图4S、T）。这些研究结果表明，Sting是BF EV诱导的巨噬细胞M2型极化过程中的关键基因，而Mef2d则是被BF EV激活的重要的下游功能基因。

图4 BF EV激活Sting-Mef2d信号通路，从而促进巨噬细胞向M2型极化

5.Trib1是BF EV-Sting-Mef2d信号通路中促进M2型巨噬细胞极化的关键靶基因

基于BF EV处理的巨噬细胞、Sting基因敲除小鼠感染结核分枝杆菌的巨噬细胞（GSE162620）以及巨噬细胞GO数据进行的维恩图分析表明，Trib1与M2型巨噬细胞以及Sting激活显著相关（图4U）。此外，基于Mef2d CUT&Tag数据、BF EV处理的巨噬细胞的转录组测序以及人外周单核细胞分化为M2巨噬细胞的转录组测序（GSE157182）进行的维恩图分析显示，Trib1是Mef2d的靶基因（图5B）。双荧光素酶测定表明，Mef2d促进了Trib1的表达（图5B-D）。在使用BF EV或C-176 + BF EV处理后，巨噬细胞中Trib1的表达水平分别上调了1.66倍或下调了2.44倍（图4F、G）。这些发现表明，Trib1是Mef2d促进巨噬细胞向M2型极化起作用的关键基因。

6.BF EV-Sting-Mef2d信号通路促进M2巨噬细胞分泌Serpine1，从而加剧T2D VC

基于BF EV处理的巨噬细胞以及从人类外周血单核细胞分化而来的M1或M2巨噬细胞的转录组测序数据（GSE157182），进行了细胞因子GO条目的维恩图分析。分析结果显示，Serpine1、Eng和Ssc5d是共有的基因（图5A）。此外，Mef2d的CUT&Tag数据表明Serpine1是Mef2d转录调控的潜在靶基因（图5B）。双荧光素酶测定证实，Mef2d在Serpine1基因内具有结合位点（图5C、E）。qRT-PCR 分析显示，BF EV显著上调巨噬细胞中的Serpine1表达（图5F）。相比之下，用C-176 + BF EV处理则导致Serpine1的显著下调（图5G）。此外，转染了pcDNA3.1-Mef2d的巨噬细胞中Serpine1显著上调（图5H），而转染了si-Mef2d的巨噬细胞中Serpine1则显著下调（图5I）。免疫荧光分析进一步证实了这些发现，表明转染了pcDNA3.1-Mef2d的巨噬细胞显著上调了Serpine1的表达，而转染了si-Mef2d的巨噬细胞则下调了Serpine1的表达（图5J-L）。ELISA显示，BF EV显著增加了巨噬细胞中Serpine1的分泌量，并且Mef2d过表达进一步促进了Serpine1的分泌（图5M）。此外，BF和BF EV的移植显著提高了T2D小鼠血清中的Serpine1水平（图5O）。值得注意的是，在T2D进展2周后，小鼠血清中的Serpine1显著上调（图5P）。这些结果表明，Serpine1是Mef2d促进M2巨噬细胞分泌的关键蛋白质。

图5对Mef2d促进巨噬细胞M2型极化及细胞因子分泌的机制的分析

7.Serpine1促进T2D VC

在用Serpine1刺激小鼠VSMC后进行的qRT-PCR检测显示，Runx2、Alp、αSMA和Sm22α的表达水平分别显著上调了（图6A）。WB分析证实Runx2和Alp的表达显著上调，而αSMA和Sm22α则表现出显著下调（图6B）。体外实验表明，Serpine1对巨噬细胞极化没有显著影响（图6C、D）。体内实验表明，通过T2D小鼠的尾静脉输注Serpine1并未导致肝脏和肾脏功能出现显著变化（图6E）。此外，qRT-PCR分析显示，Serpine1处理的小鼠主动脉中Runx2的表达显著增加，而αSMA和Sm22α则显著下调（图6F）。病理染色和免疫组织化学分析表明，Serpine1处理的小鼠未出现明显的钙化点；然而，Runx2的水平显著升高，而骨髓中CD206+细胞的数量并无显著变化（图6G、H）。综合来看，这些结果表明 Serpine1能促进T2D小鼠的血管成骨分化。

图6 T2D小鼠中Serpine1对VC的影响

8.外周血中的Serpine1是 T2D VC的风险因素

通过将THP-1细胞分化为巨噬细胞，并随后用BF EV进行处理，阐明了BF EV对人类巨噬细胞的影响及其与T2D VC的关系。流式细胞术分析显示，巨噬细胞向M2型显著极化，其数量增加了1.82倍（图7A、B）。qRT-PCR分析表明，Sting、Mef2d、Trib1和Serpine1均显著上调（图7C）。WB证实，BF EV刺激后，Sting和Mef2d均显著上调（图7D）。ELISA检测表明，在BF EV刺激后的巨噬细胞培养上清液中，Serpine1显著升高（图7E），在T2D VC的血清中也显著升高（图7F）。逻辑回归分析表明，以Serpine1、性别、年龄、甘油三酯、高密度脂蛋白和载脂蛋白A1构建的模型的AUC为0.929（p < 0.01）（图7G）。这些研究结果表明，巨噬细胞M2型极化以及Serpine1的分泌是T2D VC的重要风险因素。

图7 血清Serpine1和T2D VC临床相关性分析

当前研究表明，与T2D相关的肠道BF会分泌能促进巨噬细胞向M2型极化并释放Serpine1的细胞外囊泡，而Serpine1又会促进血管钙化。临床研究进一步证实，外周血中的M2型单核细胞/巨噬细胞以及外周血中的Serpine1是T2D VC的两个重要风险因素。本研究为优化T2D VC的预防和治疗策略提供了新的理论和实验基础。

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